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分子生物学尝试室常用仪器及使用步骤2

颁布功夫：

2025-05-20 10:01

尝试五大肠杆菌感触态细胞的造备及转化

一、尝试道理

体表衔接的沉组DNA分子导入相宜的宿主细胞中能力大量的进行复造、增殖和表白。钻研发现，用含Ca2+ 的溶液处置大肠杆菌细胞会易于吸收表源DNA。大肠杆菌吸收表源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收表源DNA的状态称为感触态。用理化步骤能够诱导细胞进入感触态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前尝试室常用的造备感触态细胞的步骤，其道理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性产生扭转，表源DNA附着于细胞膜表表，经42°C短功夫热冲击处置，推进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞通常是限度―建饰系统缺点的变异株，即不含限度性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因(AP+)。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞能力生计并成长增殖。从而能够筛选出哪个克隆含有质粒。

本尝试以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处置受体菌使其处于感触态，而后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全数受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板造就基上造就，只有转化体能力存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而殒命。转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限度性内切酶图谱的造作以及DNA测序等尝试。

二、仪器及试剂

1. 仪器：

恒温摇床、电热恒温造就箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心理、台式离心理。

2. 资料

E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：

LB造就液(1L)：

胰蛋白胨 10g

酵母粉 5g

NaCl 10g(高盐)或5g(低盐)

氨苄青霉素(Ampicillin) 100mg/ml

在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的沉蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃，向溶液中参与1.5ml 100mg/ml 的氨苄青霉素。而后贮存于4℃备用。

LB平板造就基：

胰蛋白胨 10g

酵母粉 5g

NaCl 10g或5g ，

琼脂 13g

在三角瓶中顺次将上述配方参与1L的沉蒸水中并高压灭菌。待造就基降温至50℃，取出造就基并轻轻旋转以使溶化的琼脂均匀散布于整个造就基溶液中，凭据必要参与氨苄青霉素，而后可直接从三角瓶中倒出造就基铺造平板。90mm直径的造就皿约需30～50ml造就基。造就基齐全凝固后，颠倒平皿并贮存于4℃备用。

其它试剂： 0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水

三、操作步骤

1. 感触态细菌的造备：

(1)用接种环从E.coli JM109菌平板上挑取一单克隆菌落，接种于装有5ml LB液体造就基的试管中中，37℃ 220 rpm振荡造就过夜(12～16h)。

(2)取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体造就基三角瓶中中，37℃，220 rpm振荡造就2-3h，隔20-30min丈量OD600值，至OD600值为0.3-0.4。无菌前提下将细菌转至1.5ml 离心管中，每管1ml菌液，按必要决定管数。

(3) 4℃，12000 rpm，离心2 min，以回收细菌。

(4)倒净上清液，颠倒离心管于滤纸上1min，使残留的痕量造就液流尽。每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min 。

(5)4℃，12000 rpm，2 min。

(6)倒净上清液，颠倒离心管1min，使残留液流尽。每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L CaCl2沉新悬浮细胞(沉悬时操作要轻)，即成感触态细胞悬浮液。

2.细菌转化：

(1)取3只灭菌的Ep管，别离编号1、2、3、别离参与以下各组分：参与10～20ng质粒DNA(体积幼于10ul)，同时做两个对照组：

1号：受体菌对照组： 100ul感触态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O

2号：质粒DNA对照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

3号：正常转化组：100ul感触态细胞悬浮液+2ul pUC19

(2)轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，推进DNA分子在感触态细胞表表的吸附。

(3)转入42℃水浴2min，通过热刺激加强CaCL2的作用，使细胞膜产生通路，便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。

(4)迅速转入冰上冷却2min，建复细胞膜。

(5)加600u无抗生素lLB液体造就基，摇匀后于37℃，220 rpm，振荡60min。使受体菌复原正常成长状态，并且表白Ampicillin抗性基因。

(6)取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，将平板置于无菌台直至液体被吸收，37℃恒温造就箱颠倒造就12-16h后观察了局，其余保留于4℃。若是平板上没有长出菌落，可将之置于37℃恒温造就箱持续造就，同时将剩下的500ul菌液离心，倒掉大部门上清，留100ul左右，用移液器奏乐沉悬，再全数涂于含Ampicillin的LB平板上，置37℃造就。

(7)观察并纪录转化子出现的数量，推算转化率。

四、当苦衷项：

1. 尝试中所用的器皿均要灭菌，以预防杂菌和表源DNA的传染。

2. 尝试过程中要把稳无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。

3. 必须设对照组，以检验尝试过程中是否有传染。

4. 整个尝试过程均需置于冰上。

5. 选用对数成持久细胞，OD600不应高于0.6。

尝试六动物组织细胞基因组 DNA提取

一、尝试道理

真核生物的所有有核细胞(蕴含造就细胞)都能用来造备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的大局存在于细胞核内，因而，造备DNA的准则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要维持DNA分子的齐全。提取DNA的通常过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分化蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的沉要个性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存鄙人维持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反映系统中，SDS可粉碎细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑造细胞中Dnase的活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成幼肽或氨基酸，使DNA分子齐全地分离出来。

二、仪器及试剂

1. 仪器：

恒温水浴锅、台式离心理、紫表分光光度计(GeneQuant)、移液器、玻璃匀浆器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)

2. 试剂：

(1)细胞裂解缓冲液：

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

(2) 蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

(3)TE缓冲液(pH 8.0)：高压灭菌，室温贮存。

(4)酚?氯仿?异戊醇(25:24:1)、

(5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3)，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，参与1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，参与蛋白酶K (500ug/ml)20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心理以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，能够看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 沉新溶化。(可进行PCR反映等，必要进一步纯化的按下列步骤进行)

3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，参与等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，参与1/2体积的7.5mol/L乙酸氨参与2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.幼心倒掉上清液，将离心管颠倒于吸水纸上，将附于管壁的残存液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.幼心倒掉上清液，将离心管颠倒于吸水纸上，将附于管壁的残存液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE沉新溶化沉淀物，而后置于4℃或?C20℃保留备用。

10.汲取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

四、常见问题

1.选择的尝试资料要新鲜，处置功夫不易过长。

2.在参与细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以削减DNA团块形成。

3. 提取的DNA不易溶化：不纯，含杂质较多;加溶化液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶化变得很难题。

4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作失慎;传染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA的A280/A260幼于1.8;不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应参与SDS至终浓度为0.5%，并沉复步骤2～8。

6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸�。汉吲ǘ鹊腄NA，可加大抽提前缓冲液的量或削减所取组织的量。

尝试七 DNA的定量

一、尝试道理

核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波利益有特异的紫表吸收峰，其吸收强杜纂核酸的浓度成正比，这个物理个性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml�Ｄ芄淮死赐扑愫怂嵫返呐ǘ�。

紫表分光光度法不只能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫表线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有RNA传染，低于1.8则有蛋白质传染。

对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。DNA 自身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭(EB)插入DNA 的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫表光的引发下产生桔红色荧光。荧光强杜纂被结合的EB的量成正比，而被结合的EB的量又与核酸分子长度和含量成正比，使用一系列已知的分歧浓度DNA溶液作尺度对照，可比力出被测DNA溶液的浓度。活络度可达1～5ng。由因而基于目测，所所以估计水平。该步骤经济轻便，但正确性较低。

二、仪器及试剂

1. 仪器：Amersham GeneQantTM Pro 紫表可见分光光度仪，琼脂糖凝胶电泳设备。

2. 试剂及配造：

5×上样缓冲液：

配造10 ml

0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 ml

10% SDS 50 ul

50% 甘油 2.5 ml

0.2% 溴酚蓝 10 mg

0.2% 二甲苯青FF 10 mg

加去离子水至10 ml

其它试剂：0.1×TE 、DNA尺度液，EB贮存液(10 mg/ml)，

三、尝试步骤

1.紫表分光光度法

(1)用0.1×TE对待测DNA样品按1:20或相宜的倍数稀释。

(2)开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口

(3)调零。吓酌0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关关盖板。点击“set ref”键，仪器自动校对零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

(4)吸70 ul已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关关盖板。若是样品很少，能够用5～7ul的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260和280nm处的光密度(OD值)及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA样品的浓度等。

(5)打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用高纯水清洁石英样品杯，风干后，再参与下一个待测样品。

(6)DNA纯度：以OD260/ OD280比致反反映。当OD60 /OD80比值 <1.8时，注明样品存在蛋白质或酚等杂质，可选取平衡酚/氯仿―异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，注明样品存在RNA传染，能够用RNA酶处置样品去向RNA。

2. EB荧光分析法

(1)琼脂糖凝胶的造备。

(2)样品的筹备。把待测DNA样品进行1:2陆续稀释，并筹备一份DNA尺度液作对照。

(3)上样。稀释样品与上样缓冲液按1:5混合均匀后上样。

(4)电泳。用100V稳压电泳至溴酚蓝批示剂迁徙到凝胶的3/4处终场电泳。

(5)取出凝胶，入EB荧光染液中作用20min，取出后净水漂洗干净，而后紫表检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA 80ng。此法也可用于相识核酸样品中的严沉传染滋扰核酸紫表线吸收物质的情况。

四、常见问题

1. 紫表分光光度法不能分辨DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线状三种构型，也不能分辨染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以排除RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等成分的影响，因而测得的数据往往比现实浓度偏高。

2.OD320值是布景，若溶液盐浓度越高，OD320也越高。

3.测样品时使用的石英样品杯比力贵，要幼心不要摔破，持杯时也不要接触通明的光面以预防滋扰测定。

尝试八 PCR基因扩增

一、尝试道理

聚合酶链式反映(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种体表核酸扩增系统，其道理类似DNA分子的天然复造过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延长若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必须工具。

PCR的工作法式现实上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反映。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链;②退火，忽然降低温度后模板DNA引物按碱基配对准则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构单一等特点，重要的结合产生在引物与模板之间;③延长，在DNA聚合酶及镁离子等的存在前提下，从引物的 3 ′端起头，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。实现以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增长一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。现用图示注明PCR道理:

二、仪器及试剂

1.仪器：PCR仪、台式离心理、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等

2.试剂：

10X PCR 缓冲液配造(部门随Taq酶提供)：

250～500 mmol/L KCl

100～500 mmol/L Tris-Cl(pH8.4)

15～20 mmol/L MgCl2

0.5% Tween-20

1mg/L BSA

其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶、等

三、操作步骤

1. PCR 系统(40ul)：

4ul 10XPCR 缓冲液

4ul 25mM MgCl2(凭据分歧公司PCR 缓冲液的分歧而定)

Xul 模板DNA ≥50ng

1ul 上游引物(50-100ng)

1ul 下游引物(50-100ng)

1ul dNTP Mixture(终浓度20-200uM)

0.4 ul Taq聚合酶

加ddH2O至40ul

视PCR仪有无热盖，不加或增长石蜡油。

2. 将上述试剂顺次参与PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm离心15 sec使反映成分集于管底。

3. PCR反映热循环法式设置：

(1) 95℃ 300s 变性

(2) 94℃ 45s 变性

(3) 55℃ 45s 退火(凭据分歧引物可能有分歧退火温度)

(4) 72℃ 45s 延长(每分钟可延长1kp)

沉复步骤2-4共 30 循环

(5) 72℃ 600s 延长

反映实现后短暂离心，汲取少量(10ul)进行分析，其余置

4℃保留备用。

4. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产品。

四、当苦衷项：

1. PCR 系统所加成分的现实用量应凭据尝试者选用的该成分的终浓度及所占有的贮备液浓度进行核算。

2.加样时要当真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以预防错加或漏加，预防传染。

3.Taq聚合酶(置于冰盒上)应最后参与，尽量削减室温接触机遇。加酶时吸头深刻不成过深，酶量不能过多。

五、影响PCR的重要成分

1.模板DNA

单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的传染。模板用量依具体尝试而定，通常为100ul反映液有105-106个指标分子。PCR反映时模板变性要充分。

2. PCR引物

PCR引物设计是否成功是能否获得高质量PCR产品最关键的成分之一。在设计和利用时，需把稳以下沉要环节：

(1)PCR引物的长度约为18～30个核苷酸，并且成对引物间的G+C含量应类似。以使它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C含量应为45%～55%之间。碱基散布是随机的，应预防陆续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3，端出现3个陆续G或C，不然会使引物在G+C富集序列区谬误引发。引物3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地预防选用T ,尤其应预防陆续出现2个以上T。

(2)通常来说，PCR产品≤500bp时，引物长度选择16-18bp;PCR产品≥5kb时，引物长度选择24bp左右为宜。

(3)要预防引物分子自身序列互补，不然会形成发夹样二级结构。两个PCR引物相互之间的3，结尾序列不能有显著的互补性，以免形成引物二聚体。

(4)引物的熔点温度(Tm值)要适当。Tm值与引物的碱基组成和长杜仔关;PCR引物的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。通常熔点温度以大于55℃为宜。

(5)引物的3，结尾必须与模板严格互补，而5，结尾的要求可矫捷些。

(6)目前在引物选择中已宽泛利用推算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。

(7)用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限度性内切酶位点。为了保障内切酶有效酶切扩增产品，通常在酶切位点的5，端再加上几个额表的碱基。

(8)引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的领域内产量根基一样，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增长引物二聚体的产生。

3. 热不变DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)

通常用量为2.5 U/100uL 反映体积。酶量过多易导致非特异性产品的产生。该类酶的最适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不齐全配对的引物-模板的非特异延长及引物二聚体的扩增延长，所以该把稳预防非特异性产品的出现。

4. dNTPs

PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种dNTPs应等当量。浓度

低则反映速度降落，过高则特异性降落，可凭据具体尝试来确定最适的dNTP浓度。

5. PCR缓冲液

因PCR反映中的dNTP能与Mg2+结合，影响反映液中游离Mg2+的浓度，所以应按分歧前提，确定相宜的Mg2+浓度。通常在尺度的PCR反映中(dNTP浓度200umol/L)，Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产品特异性。浓度高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著降落。利用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫苏糖醇(DTT)对酶有肯定的�；ぷ饔�。

6. PCR循环的温度

预变性：肇始变性的功夫应该长些，以使变性充分。通常为94℃ 3-5min。变性不齐全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反映，但若变性温度太高(不宜超过95℃)，会影响Taq酶的活性。

变性：通常为94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：应凭据具体反映中引物与模板的碱基配对情况及尝试的目简直定。通常为50-72℃。退火温度增高会加强对不正确退火引物的鉴别，还能降低引物3，端不正确核苷酸的谬误延长。

延长：通常为72℃ 60-90s。最后一个循环后应在72℃保留5min，以保障PCR产品合成的齐全性。

7. 平台效应和PCR循环的次数

在PCR基因扩增的后期，由于产品的堆积，将使原来产品以指数增长的速度变为平展曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR原料的不休亏损、酶的不变性的降低、终产品的阻滞效应及非特异性产品等多种成分造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR产品，又不要无意思地增长循环次数。

8. 操作环境

预防环境传染和交叉传染，如核酸酶的传染、非指标DNA的传染等。

尝试九琼脂糖凝电泳分离与纯化主张DNA

一、尝试道理

分离和纯化DNA酶切片段是基因工程中常用的伎俩。在电泳过程中分歧大幼的片段分离位于分歧的地位，切下主张片段并选取低熔点琼脂糖回收法即可获得主张片段。有很多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时溶解成液体，在30℃时凝固成凝胶。由于双链DNA的解链温度高于65℃，所以能够溶解凝胶而DNA并不变性，在凝胶成液态时回收DNA片段。该法的利益是可直接在溶解的凝胶中进行各类酶反映，如合成同位素探针、进行限度酶切割和衔接反映等。

二、仪器及试剂：

1.仪器

电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心管、吸优等。

2.试剂：

低熔点琼脂糖、待纯化的DNA、凝胶回收试剂河注去离子水或TE(pH7.6)。

三、操作步骤：

1.配造1%的琼脂糖凝胶，在适当的地位切一条与加样槽平行的槽，换低熔点琼脂糖凝胶。

2.加样，100V电泳，观察所需片段是否移至低熔点胶内。

3.在紫表灯下切含有DNA的低熔点胶，置1.5 ml离心管中，于70℃热水中溶解。

4.按凝胶回收试剂盒说明书操作。

12.取适量纯化好的主张DNA在 GeneQuant 中检测，确定纯度和浓度，其余样品于-20℃保留。

四、当苦衷项：

1. 配凝胶的三角瓶、电泳槽和配胶板要先冲刷干净

尝试十 DNA沉组

一、尝试道理

表源DNA与载体分子的衔接就是DNA沉组，这种沉新组合的DNA叫做沉组子。DNA在体表的衔接沉组是基因工程操作的主题技术之一，其性质是一个酶促反映过程。即在肯定的前提下，DNA衔接酶催化两个双链DNA片段的5?端磷酸和3?端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA衔接酶有两种：T4噬菌体DNA衔接酶和大肠杆菌DNA衔接酶。其中T4噬菌体DNA衔接酶对底物的要求低，能更有效地衔接DNA的平结尾，利用更宽泛。

T4噬菌体DNA衔接酶催化DNA衔接反映分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA衔接酶通过ATP的磷酸与衔接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5?端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。③DNA链3?端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5?端的磷酸根形成磷酸二酯键，并开释出AMP，实现DNA之间的衔接。T4噬菌体DNA衔接酶必要镁离子和ATP作为辅助因子，在肯定的温度和pH前提下进行衔接反映。

二、仪器及试剂：

1. 仪器：

台式离心理、移液器、吸头、恒温水浴锅等。

2. 试剂：

T4 DNA衔接酶、10×T4 DNA衔接酶缓冲液、载体DNA、表源DNA。

三、操作步骤

1. 表源DNA片段和载体DNA的衔接

取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列挨次参与各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol

酶切后的载体DNA *2 约0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA片段的摩尔数应节造在载体DNA摩尔数的3-10倍。

*2 一样结尾的载体与DNA片段进行衔接时，应首先将载体进行去磷酸化处置，以预防其自身环化。

2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心理离心2s 以集中溶液。

3.将反映管放入16℃过夜反映(12～16h)。

4.取出约25ng的DNA衔接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定衔接了局，以未经衔接的质粒DNA片段和酶切DNA片段作电泳。

5.用0.1×TE将衔接混合物稀释至50ul，使用10～20ul转化大肠杆菌感触态细胞。

四、当苦衷项

1. 衔接产品经鉴定后应迅速做转化尝试。

2. 凭据具体情况调节酶的用量。平端衔接或接头衔接都比黏端衔接慢得多，并且酶的用量也增大。

3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端衔接的效能。

4. 预防载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处置线性载体，去掉载体的5??C磷酸以抑造DNA片段的自身环化。

5. 正确调整载体DNA和表源DNA之间的比例有助于获得高产量的沉组产品。

五、有关问题

1. 衔接反映的影响成分

除了载体、供体的浓度及其比例等成分表，影响衔接反映的成分还有好多，如缓冲液组分、衔接温杜纂功夫、酶浓度、DNA浓度及片段结尾的碱基序列等。

(1)衔接缓冲液的影响

分歧的公司提供的衔接缓冲液可能有所分歧，但大体上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的领域在7.4-7.8，较多用7.8，主张是提供相宜酸碱度的衔接系统;10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反映;1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，不变酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增长蛋白质的浓度，预防因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限度酶缓冲液分歧的是衔接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反映所必须的。

(2)pH的影响

通常将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有尝试批注，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么系统偏碱(pH为8.3)时仅为全数活力的65%;当系统偏酸(PH为6.9)时仅为全数活力的40%。

(3)ATP浓度的影响

衔接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。钻研发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑造反映。例如，5mmol/L的ATP会齐全抑造平结尾衔接，黏端的衔接也有10%被抑造;还有报路，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分化，所以当衔接反映失败时，除了DNA与酶的问题表，还应试虑ATP的成分。含有ATP的缓冲液应于-20℃保留，熔解取用后立即放回。衔接缓冲液体积较大时最好分幼管贮存，预防反复冻融引起ATP分化。与限度酶缓冲液分歧的是，含ATP的衔接缓冲液持久搁置后往往失效，所以也可自行配造不含ATP的缓冲液(可持久保留)，临用时参与新配造的ATP母液。

(4)衔接温杜纂功夫的影响

由于黏性结尾的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不不变，但衔接酶的最适温杜字恰为37℃。为相识决这一矛盾，在经过综合思考后，传统大将衔接温度定为16℃，功夫为4-16h。现经尝试发现，对于通常的黏性结尾来说，20℃ 30min就足以获得相当好的衔接成效，当然若是功夫丰裕的话，20℃ 60min能使衔接反映进行得更齐全一些。对于平结尾是不用思考氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的阐扬。

(5)酶浓度的影响

凭据New England Biolabs公司对T4 DNA衔接酶的界说，1U的酶可在16℃ 30min内衔接20ul系统中Hind Ⅲ酶切片段(黏性结尾为0.12umol/L 5,结尾，此时DNA质量浓度约为300ng/ul)的50%。日常使用的DNA浓度比酶单元界说状态低10-20倍，衔接平结尾时酶用量要比衔接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求，又往往提供高浓度的酶(几百个单元/ul)，所以进行黏结尾衔接时需先行稀释。除了立即用于反映的部门可用酶反映缓冲液稀释表，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与酶保留缓冲液一样或类似，稀释液中的酶能在长功夫维持活力，也便于随时取用。

(6)DNA浓度的影响

只管有的尝试手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但思考到用质粒作为载体克隆时，最后要求得到环化的有效衔接产品，所以DNA浓度不成过高，通常不会超过20nmol/L。相比力而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆过程最后要求线性化的衔接产品，所以，DNA的浓度能够高些，至少是靠近推荐的浓度。此表，在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的衔接反映中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据钻研，T4 DNA衔接酶对DNA结尾的表观Km值为1.5nmol/L，所以，衔接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应拥有2nmol/L的结尾浓度。

2. 三种衔接酶单元界说

(1)Weiss单元

衔接酶单元最早是1968年由Weiss提出的Weiss单元，现也称PPi单元。他的单元界说为：37℃ 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。此刻大无数厂商仍使用这种单元。

(2)d(A-T)环化单元

由于Weiss单元界说中测试的是T4 DNA衔接酶中除衔接职能表的另一种磷互换职能，并且测试温度高达30℃，与现实衔接反映相比无论在哪一方面都有肯定的差距，因而，1970年Modrich与Lehman提出了真正怀抱衔接职能的d(A-T)环化单元，又称表切酶抗性检测。d(A-T)环化单元的界说为：30℃ 30min 内将100nmol/L的d(A-T)(约2kb长)转化成抗表切酶的大局。

(3)黏性结尾单元

与Weiss单元相比，d(A-T)环化单元更靠近现实，但仍有肯定的问题，例如，环化单元测试中用的是纯AT片段，与现实衔接中4种碱基随机分列不符;再说，若是衔接酶将片段衔接成多聚体而末环化时，仍可能被表切酶组所切;除此之表，与现实上大无数衔接反映使用的温度16℃相比，30℃仍显得偏高。为了衡量现实衔接前提下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最实用的黏性结尾单元，它的单元界说为：16℃ 30min内将5,结尾浓度为0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%衔接上。

尝试十一动物组织细胞总RNA的提取

一、尝试道理

RNA是基因表白的中央产品，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有沉要职位�；竦酶叽慷群推肴腞NA 是好多分子生物学尝试所必须的，如Northern杂交、cDNA合成及体表翻译等尝试的成败，在很大水平上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部门RNA是以核蛋白复合体的大局存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速粉碎细胞结构，使核蛋白与RNA分离，开释出RNA。再通过酚、氯仿蹬仔机溶剂处置、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑造内源和表源的RNase活性，�；NA分子不被降解。因而提取必须在无RNase的环境中进行�？墒褂肦Nase抑造剂，如DEPC是RNase的强抑造剂，常用来抑造表源RNase活性。提取缓冲液中通常含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑造RNase活性。并有助于除去非核酸成分。

本尝试介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳进行鉴定。

二、仪器和试剂

1.仪器：

超净工作台、高速冷冻离心理、电泳仪、紫表分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h;不耐高温的器皿(如塑料制品)利用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

2.试剂：

(1)细胞裂解液：

异硫氰酸胍 4mol/L

柠檬酸钠(pH7.0) 25mmol/L

十二烷基肌氨酸钠 0.5%

β-巯基乙醇 0.1mol/L

称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，汲取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶化，定容至50ml。而后取以上配造的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，齐全溶化后4℃保留备用。

(2)10×凝胶缓冲液：

吗啉代丙璜酸(MOPS)(pH7.0) 200mmol/L

NaAc 100mmol/L

EDTA(pH 8.0) 10mmol/L

过滤除菌后避光保留。

(3)5×变性上样缓冲液：

水鼓和的溴酚蓝 16μl

500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80μl

甲醛(37%) 720μl

甘油 2ml

甲酰胺 3084μl

10×凝胶缓冲液 4ml

加无RNase水至10ml，4℃可保留3个月。

(4)TRIzol RNA抽提试剂

(5)2mol醋酸钠

(6)0.1% DEPC

(7)平衡酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)

(8)平衡酚、氯仿

(9)无水乙醇、70%乙醇、异丙醇

(10)无RNase水

三、操作步骤

(一)异硫氰酸胍法(PLT)

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，参与预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。而后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2.参与2mol醋酸钠(pH4.0)120μl，充分混匀。

3.参与1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4.将混合物转移至1.5ml Ep管中，4℃，离心10 000r/min,20min.

5.移取上层水相至另一Ep管中，参与等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA.

6. 4℃，离心12 000r/min，15min.

7. 弃上清液，参与70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物;若是RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10 000r/min，10min。

8. 弃上清液，天然干燥，但应预防沉淀齐全干燥，不然RNA难以溶化。

9.参与100μl无RNase水沉悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠(pH4.0)，?C70℃保留。

(二)TRIzol试剂提取RNA

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，参与预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。而后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室温下静置5min。

2.参与200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。

3. 4℃，10 000r/min离心15min，RNA散布于水相中。

4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，参与500μl 异丙醇，室温静置10min。

5.4℃，10 000r/min离心10min。

6.弃上清液，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。

7.弃上清液，室温干燥15min.

8.向干燥过的沉淀物中参与200μl DEPC处置水(无核水)溶化沉淀物，于-20℃保留备用。

(三)RNA检测

1.在紫表分光光度计上检测RNA浓度及纯度。

步骤同尝试四，用DEPC处置水校对零点;用DEPC处置水稀释RNA样品;读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测

(1)造备凝胶(1.2%)。称1.2g琼脂糖，加72ml DEPC处置水，加热溶解。冷却至60℃，在透风橱内参与10×凝胶缓冲液10ml，甲醛(37%)18ml，混匀后，倒胶。

(2)造备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4：1混匀。65℃温育5～10min，迅速在冰上冷却5min，离心数秒。

(3)上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5～2h.。

(4)待溴酚蓝迁徙至凝胶长度的2/3～4/5处实现电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液(0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配造)中染色约30min。

(5)在凝胶成像系统观察并分析。

四、当苦衷项

1.RNA是极易降解的核酸分子。因而提取总RNA必须在无RNase 环境中，戴口罩、手套、使用无RNase传染的试剂、资料、容器。

2.所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处置过夜，而后高压处置或加热至70℃ 1 幼时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。

3.所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处置的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温前提可减低RNA酶活性。

4.凭据RNA样品的紫表吸收OD值，可推算出RNAd 浓度。

单链RNA [ssRNA]=40×(OD260-OD310)×稀释倍数

纯RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,注明有蛋白质等传染，利用酚/氯仿在抽提。若比值低于2.0,批注有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。

5.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S幼分子RNA条带，则注明齐全性好。若有降解可能是操作不当或传染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2：1,批注RNA无降解。如比值逆转，则批注RNA降解。电泳中若是在28S 后方还有条带，批注有DNA传染，利用DNase处置后再进行纯化。

重要参考书：

1..金冬雁等译.分子克隆尝试指南. 第二版.北京：科学出版社，1995

2.子颖等译.精编分子生物学尝试指南. 科学出版，

3.周俊宜编.分子生物学根基技术和战术. 科学出版社

4.姜泊等编.分子生物学常用尝试步骤.北京：人民军医出版社，1996.

5.刘进元等编.分子生物学尝试领导.北京：清华大学出版社，2002.

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