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蛋白质提取与纯化技术

颁布功夫：

2025-05-20 10:06

选择资料及预处置

以蛋白质和结构与职能为基础，闯辗视水平上意识性命景象，已经成为现代生物学发展的重要方向，钻研蛋白质，首先要得到高度纯化并拥有生物活性的主张物质。蛋白质的造备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但根基道理不表乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差距，把它们分配到可用机械步骤分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离主张，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些步骤的利用中必须把稳保留生物大分子的齐全性，预防酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的失落。蛋白质的造备通常分为以下四个阶段：选择资料和预处置，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保留。

微生物、植物和动物都可做为造备蛋白质的原资料，所选用的资料重要凭据尝试主张来确定。对于微生物，该把稳它的成持久，在微生物的对数成持久，酶和核酸的含量较高，能够获得高产量，以微生物为资料时有两种情况：(1)得用微生物菌体排泄到造就基中的代谢产品和胞表酶等;(2)利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物资料必须经从前壳，脱脂并把稳植物种类和成长发育情况分歧，其中所含生物大分子的量变动很大，另表与季节性关系亲昵。对动物组织，必须选择有效成份含量丰硕的脏器组织为原资料，先进行绞碎、脱脂等处置。另表，对预处置好的资料，若不立即进行尝试，应冷冻保留，对于易分化的生物大分子应选用新鲜资料造备。

蛋白质的分离纯化

一，蛋白质(蕴含酶)的提取

大部门蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇蹬仔机溶剂中，因些，可选取分歧溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐缓和冲系统的水溶液对蛋白质不变性好、溶化度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原资料体积的1-5倍，提取时必要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶化。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，无数蛋白质的溶化度随着温度的升高而增大，因而，温度高利于溶化，缩短提取功夫。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因而，基于这一点思考提取蛋白质和酶时通常选取低温(5度以下)操作。为了预防蛋白质提以过程中的降解，可参与蛋白水解酶抑造剂(如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等)。

下面着沉会商提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值

蛋白质，酶是拥有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 领域内。用稀酸或稀碱提取时，应预防过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团产生变动，从而导致蛋白质构象的不成逆变动，通常来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

稀浓度可推进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部门结合，拥有�；さ鞍字什灰妆湫缘睦�，因而在提取液中参与少量NaCl等中性盐，通常以0.15摩尔。升浓度为宜�；撼逡撼Ｑ∪�0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

(二)有机溶剂提取法

一些和脂质结合比力牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇蹬仔机溶剂，它们具的肯定的亲水性，还有较强的亲脂性、是梦想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合缜密的蛋白质和酶出格优越，一是由于丁醇亲脂性强，出格是溶化磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性，在溶化度领域内(度为10%，40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另表，丁醇提取法的pH及温度选择领域较广，也合用于动植物及微生物资料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化步骤好多，重要有：

(一)凭据蛋白质溶化度分歧的分离步骤

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶化杜仔显著影响，通常在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶化度增长，此称盐溶;当盐浓度持续升高时，蛋白质的溶化度分歧水平降落并先后析出，这种景象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可篡夺蛋白质分子的水化层，使之“失水”，因而蛋白质胶粒凝固并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则成效更好。由于各类蛋白质分子颗粒大幼、亲水水平分歧，故盐析所需的盐浓度也不一样，因而调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各类蛋白质分段沉淀。

影响盐析的成分有：(1)温度：除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作表，通常可在室温中进行。通常温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶化度低，更容易盐析。(2)pH值：大无数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质时时同化着其他蛋白质地一路沉淀出来(共沉景象)。因而在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，重要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中利用最多的硫酸铵，它的利益是温度系数幼而溶化度大(25度时鼓和溶液为4.1M，即767克/升;0度时鼓和溶化度为3.9M，即676克/升)，在这一溶化度领域内，很多蛋白质和酶都能够盐析出来;另表硫酸铵分段盐析成效也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，必要将蛋白质中的盐除去，常用的法子是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸)，用缓冲液进行透析，并不休的更换缓冲液，因透析所需功夫较长，所以最好在低温中进行。此表也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的法子除盐，所用的功夫就比力短。

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最幼，因而溶化度也最幼，各类蛋白质的等电点有差距，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使无数蛋白质溶化度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

(二)凭据蛋白质分子大幼的差此外分离步骤

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大幼分歧的蛋白质分隔。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他幼的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择分歧孔径的泸膜截留分歧分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析，这是凭据分子大幼分离蛋白质混合物最有效的步骤之一。柱中最常用的填充资料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。

(三)凭据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在分歧pH环境中带电性质和电荷数量分歧，可将其分隔。

1、电泳法

各类蛋白质在统一pH前提下，因分子量和电荷数量分歧而在电场中的迁徙率分歧而得以分隔。值得器沉的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐步增长的pH梯度，当带肯定电荷的蛋白质在其中泳动时，达到各自等电点的pH地位就终场，此法可用于分析和造备各类蛋白质。

2、离子互换层析法

离子互换剂有阳离子互换剂(如：羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子互换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT FACE="宋体">纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子互换层析柱时，带有与离子互换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子互换剂上，随后用扭转pH或离子强度法子将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见层析技术章)

(四)凭据配体特异性的分离步骤-亲和色谱法

亲和层析法(aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的步骤，它时时只需经过一步处置即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，并且纯度很高。这种步骤是凭据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其根基道理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物大局存在，每种类型的细胞都含有上千种分歧的蛋白质，因而蛋白质的分离(Separation)，提纯(Purification)

和鉴定(Characterization)是生物化学中的沉要的一部门，至今还没的单独或一套现成的步骤能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因而往往采取几种步骤结合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将资料配成稀糊状液，搁置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加快至所需速度。此法合用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，高低移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎水平比高速组织捣碎机为高，合用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处置法：用肯定功率的超声波处置细胞悬液，使细胞急剧震荡分裂，此法多合用于微生物资料，用大肠杆菌造备各类酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处置10-15分钟，此法的弊端是在处置过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和渣滓细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处置法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可选取十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜粉碎，细菌细胞壁较厚，可选取溶菌酶处置成效更好。

无论用哪一种步骤破碎组织细胞，城市使细胞内蛋白质或核酸水解酶开释到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的削减，参与二异丙基氟磷酸(DFP)能够抑造或减慢自溶作用;参与碘乙酸能够抑造那些活性中心必要有疏基的蛋白水解酶的活性，参与苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能断根蛋白水解酥活力，但不是全数，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些前提都要适合于主张物质的提取。

浓缩、干燥及保留

一、样品的浓缩

生物大分子在造备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保留和鉴定的主张，往往必要进行浓缩。常用的浓缩步骤的：

1、减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空杜高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法合用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

2、空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加快蒸发,铺成薄层的溶液，表表不休通过空气流;或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜表的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩主张，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。

3、冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之造成固体，而后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差距而达到除去大部门溶剂的主张。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于基层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。

4、吸收法通过吸收剂直接管除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必须与溶液不起化学反映，对生物大分子不吸附，易与溶液分隔。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，表加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水鼓和后要更换新的直至达到所必要的体积。

5、超滤法超滤法是使用一种出格的薄膜对溶液中各类溶质分子进行选择性过滤的步骤，不液体在肯定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时，溶剂和幼分子透过，大分子碰壁保留，这是近年来发展起来的新步骤，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并拥有成本低，操作方便，前提和善，能较好地维持生物大分子的活性，回收率高蹬着点。利用超滤法关键在于膜的选择，分歧类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最幼分子量值)等参数均分歧，必须凭据工作必要来选用。另表，超滤装置大局，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤成效的肯定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：

膜名称分子量截留值孔的大的均匀直径

XM-300300，000140

XM-200100，00055

XM-5050，00030

PM-3030，00022

UM-2020，00018

PM-1010，00015

UM-21，00012

UM0550010

用上面的超滤膜造成空心的纤维管，将好多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不休地在管中流动。而后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则幼分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析功夫缩短10倍。

二、干燥

生物大分子造备得到产品，为预防变质，易于保留，常必要干燥处置，最常用的步骤是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥合用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保留，整个装置蕴含干燥器、冷凝器及真空干燥道理表，同时增长了温度成分。在一样压力下，水蒸汽压随温度降落而降落，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时通常先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之造成固体，而后在低温低压下将溶剂造成气体而除去。此法干后的产品拥有疏松、溶化度好、维持天然结构蹬着点，合用于各类生物大分子的干燥保留。

三、贮存

生物大分子的不变性与保留步骤的很大关系。干燥的制品通常比力不变，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无显著变动，贮藏要求单一，只有将干燥的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封，维持0-4度冰箱即可，液态贮藏时该把稳以下几点。

1、样品不能太稀，必须浓缩到肯定浓度能力封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。

2、通常需参与防腐剂和不变剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的不变剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可参与底物和辅酶以提高其不变性。此表，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有肯定�；ぷ饔�。核酸大分子通常保留在氯化钠或柠檬酸钠的尺度缓冲液中。

3、贮藏温度要求低，大无数在0度左右冰箱保留，有的则要求更低，应视分歧物质而定。